乙醇热回流提取浓缩工艺

目的探讨柑桔皮总黄酮的提取及鉴别方法,以充分利用柑桔皮植物资源。
方法采用改进的乙醇热提取工艺，对影响总黄酮提取率的主要因素进行了分析,并对所提取的黄酮类物质进行验证。
结果柑桔皮提取黄酮类成分的最佳条件为：
乙醇浓度 70%；提取温度 70℃；料液比 1∶ 10；提取时间 70 min；提取 3 次。在该条件下提取率可达到 3.02%。
结论 该方法是提取柑桔皮黄酮类物质的有效途径。 
【关键词】 总黄酮；提取；柑桔皮；提取条件
黄酮类(flavontes)化合物是植物光合作用产生的一大类化合物，已知的此类化合物约有两 千多种，有以黄酮(2-苯基色酮)为母核的一类黄色色素和黄酮的同分异构体及其还原产物， 还包括黄酮醇类、异黄酮类、儿茶素类、双黄酮类及其衍生物。柑桔是我国一大果品资源， 1998 年我国柑橘产量达 1 010 万吨，到 2005 年产量达到 1 200 万吨。而桔皮占柑桔的 20%～ 25%，每年约有 240～300 万吨的桔皮生产出来［1］。桔皮中含有黄酮类化合物、叶黄素和 芳香油等物质，具有理气、健脾、化痰等功效。研究表明，黄酮类有效成分对治疗冠心病、 老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果, 无毒副作用,并以此开发出多种药品和保健食品［1～7］。 黄酮类作为桔皮的主要药用成分，改进桔皮总黄酮提取工艺,对降低提取成本,提高和稳定 提取效率显得尤为重要。本实验以广西桔皮为原材料,采用改进的乙醇热回流提取工艺，旨在最佳条件下获得最佳提取效果。
1 器材 
自然干燥的桔皮、无水乙醇(AR) 、95 %乙醇(AR) 、2550 紫外可见分光光度计(日本岛津)、 芦丁对照品(中国药品生物制品检定所) 。RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHBⅢ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
2 方法
2.1 桔皮总黄酮成分提取工艺及实验安排
研究桔皮中黄酮类化合物提取方法时，一般采 用溶剂直接提取后浓缩。而笔者在实验过程中发现，桔皮叶中所含的脂溶性色素等物质会使 显色法测定总黄酮时产生浑浊现象，造成很大误差。因此，本实验采用石油醚脱脂，冷却静 置，过滤除去叶绿素后再测定总黄酮（工艺如下）。 桔皮干粉——石油醚脱脂——冷却静置——过滤沉淀—— 除尽过滤——滤液——测定总 黄酮并计算提取率 
2.2 总黄酮的鉴别 
2.2.1 三氯化铝反应取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见 光下呈淡黄色，在紫外光下有明显黄色荧光斑点。 2.2.2 乙酸镁反应取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%乙酸镁甲醇溶液，加热干燥，紫外光 下呈黄褐色斑点。 2.3 总黄酮的测定 2.3.1 测定方法依据以芦丁为对照品测定柑桔皮中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同 时控制适宜 pH 值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。
2.3.2 对照品溶液制备精密称取芦丁对照品 0.008 0 g , 60%乙醇定容至 200 ml ,制成 40 μg·ml-1 贮备液备用。
2.3.3 供试品溶液制备将各正交实验所得提取液合并，回收滤液，每个样品液中取 0.5 ml 加显色剂 60%定容置 25 ml 量瓶中，精密移取 0.5 ml 定容置 10 ml 量瓶中备用。
2.3.4 标准曲线的制备分别精密移取芦丁对照品储备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ，6.0， 7.0 ml，于 25 ml 量瓶中，加入 0. 50 mol·L-1NaNO2 溶液 1. 00 ml , 摇匀, 5 min 后, 加入 0. 30 mol·L-1 AlCl3 溶液 1.00 ml , 摇匀, 加入 1. 00 mol·L-1NaOH 溶液 5.00 ml , 60% 乙醇水溶液定 容至刻度, 配制成系列芦丁乙醇标准溶液。用 1 cm 比色皿在波长 500 nm 处测其吸光度。以 吸光度值为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归，得方程 A=0.013 4C-0.002 7，r=0.999 3。
3 结果 
3.1 温度对总黄酮提取率的影响随着温度的升高，溶剂的粘度减小，分子运动速度加快， 回流提取液的扩散系数增加，促使浸提速度加快。固定乙醇浓度 70%、料液比 1∶10，提取 时间 1 h，变化提取温度。不同提取温度对总黄酮提取率的影响见图 2。从图 2 可以看出， 温度到达 70℃之前，随温度的升高，总黄酮提取率增加非常明显；但超过 70℃后增长缓慢， 75℃提取率达到最大，温度超过 80℃时，提取液的活性成分将会遭到破坏。因此，温度最 好不要超过 75℃，应选 70℃为宜。另外，温度过高，易造成溶剂的损失，提取效果反而下 降。
3.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响黄酮类物质易溶于丙酮、水、醋酸乙酯、乙醇等极 性较大的溶剂中。乙醇无毒，对天然药材细胞具有穿透能力，对许多成分溶解性能好且能抑
制酶的催化作用，因此，本研究采用乙醇为提取溶剂。在温度 70℃下，料液比 1∶10，提取 1 h，回流提取 1 次时，乙醇浓度对总黄酮的提取效果见图 3。乙醇浓度在 70%以前，提取率 总是随着乙醇浓度的增加而增加，之后慢慢变小。可能是由于总黄酮包括黄酮苷和苷元，黄
酮苷在水和乙醇中都易溶解，但苷元的水溶性较差，而 70% 乙醇对黄酮苷和苷元都有较好 的溶解性。因此，70%的乙醇提取桔皮总黄酮的效果最好。
3.3 提取时间对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度 70%，提取温度 70℃ ，回流提取 1 次，料液比 1∶10，不同提取时间对总黄酮提取率的影响见图 4。提取时间决定着生产的周 期，是生产工艺研究中一个十分重要的影响因素，它决定着生产成本和能源的消耗。从图 4 可以看出，黄酮类化合物的提取率在 70 min 以后增长趋于平缓。时间过长，延长生产周期， 会增加生产成本和能源消耗。所以，提取时间以 70 min 为宜。
3.4 料液比对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度 70%，提取温度 70℃ ，回流提取 1 h， 回流提取 1 次，变化料液比，不同料液比对总黄酮提取率的影响见图 5。从图 5 可以看出， 随着溶剂量的增加，总黄酮的提取率逐渐升高，到 10 倍量时基本上达到最高，一般来说， 料液比越高，提取率也越高。在本实验中，黄酮的提取率随料液比的增加逐步升高，到 1∶ 10 基本达到最大值，随后则变化不大。但是料液比过大，给后处理工序增加困难，而且增 加生产成本，在保证提取效果的同时，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷，因此料液
比以不超过 1∶10 为宜。 
3.5 提取次数对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度 70%、提取时间 1 h，料液比固定 1∶
10，温度 70℃，变化提取次数。不同提取次数对总黄酮提取率的影响见图 6。从图 6 中可以 看出，回流提取次数的增加，总黄酮的提取率增加。当提取 1 次时明显不如浸提 3 次的效果 好。浸提 3 次以上时，它们的提取率增加缓慢，效果不明显。随浸提次数增加，其它杂质的 溶出增加量也会有所增加，增加溶剂的回收和造成溶剂的损失，且生产周期增加，这是不经
济的。因此，桔皮总黄酮的回流提取次数以 3 次为宜。 
4 结论
采用改进的提取工艺,以乙醇为溶剂提取桔皮叶中的黄酮类物质，工艺上增加对脂溶性成分处理，研究了各因素对提取率的影响，桔皮叶提取黄酮类成分的最佳条件为：乙醇浓度 70% ；提取温度 70℃ ；料液比 1∶10；提取时间 70 min；提取 3 次。结果表明，在该条件 下提取率可达到 3.02%。