过柱子（柱层析分离）技巧分享，方法，手段，问题总结

在药厂的时候一直觉得拿到一个化合物直接过柱子是一个很low的操作。
结晶，打浆，减压蒸馏，酸碱洗等方法来纯化，
如果不能的话还会考虑能不能转化上个保护基啥的，在其他步骤去纯化。
过柱纯粹是个无奈之举。

直到后来进到高校，做起来了毫克级别的反应，才发现上述方法真的不适用，过柱子真的的很香。

而且目前在菜籽实验室来讲，过柱子的手段太多了，除了人力，还有过柱机，有循环正向制备，有高效液相制备，量少了偷个懒是完全可以的。
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当然，像菜籽这样“特权的”人并不多，“普通人”想要用，是要求他们把传统柱子过好才可以预约的。
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我们常说过柱子其实就是柱层析分离，也叫柱色谱，1903年由俄国科学家首次发明使用，其把植物色素的溶液经过粉碎的碳酸钙粉末，发现从上到下在碳酸钙粉末上有不同的色带，通过对不同色带的分开提取，得到了较纯叶绿素，叶黄素等。
该方法经过经过百年的发展至今已经比较成熟，固定相也从单一的碳酸钙粉末发展到了氧化铝（又分为酸性、中性、碱性），硅胶，活性炭等，其中各大实验室最常用的便是硅胶，一般分为正相硅胶和反相硅胶！
固定相（硅胶）一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀统一，理论上其颗粒越小、同单位质量表面积越大，吸附能力就越高，分离效果也就越好。但是实际使用中固定相的颗粒太小时往往会存在两个情况，一个是其质更轻，容易飘散在空气中（硅胶进入人体无法降解，越细越毒）；二是颗粒小也会导致颗粒之间缝隙小，从而使溶剂的流速就太慢，耗时；以硅胶为例，目前已经商业化用量最大的硅胶尺寸为200-300目。
过柱手段这块，除了前面说的正向循环制备，高效液相制备，过柱机这些自动分析的设备，手动过柱方面主要分为常压过柱，减压过柱，加压过柱三种。
其中减压过柱，因为洗脱剂流速过快，会损失大半部分塔板数，分离效果较差，适合分离TLC板子分的比较开的样品，尤其适合产物只有一个大极性杂质的样品；所有其大多数时间被用于化合物的预处理，过掉部分杂质后再仔细纯化。要注意的是，使用过程中因为负压带来的溶剂挥发，会导致柱子外表面大量水珠凝结，对水敏感的化合物不要轻易尝试。
常压过柱是三者中分离效果最好的一种过柱方式，但是因为很多时候溶剂走的太慢，分离效果再好也会影响效率，所以这时候一般会给与压力，这就是所谓加压过柱；但这个压力不宜过高，一般手动的用双链球，自动的就用个养鱼泵，两者都可以如图改装一下。
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## 以正相柱层析为例子，讲一下常规的过柱流程：
1，准备工作要做好
选取柱子时，观察有无砂板，没有砂板的柱子记得底部填一些棉花，棉花不宜太厚也不宜太薄，能挡住硅胶不下来就好(菜籽直接拆一个衣架，用其将棉花塞入旋塞上面的出液口)
配套的准备好最小极性的的洗脱剂，紫外灯（实验室个人推荐手提式，随时可以照一照），加压设备，以及试管架！
2.选取合适的柱子，加入硅胶，浸润硅胶，拍平
柱子的选取非常重要，大小应该根据产物的量来计算，一般可以分为几毫克的柱子（全合成最终的选择）；几十毫克的柱子（方法学扩底物）；500毫克到1克的柱子（方法学做原料）；5g左右的柱子，以及更大规模。
实验室最常见柱子直径和高度比值一般在1:2.5到1:15之间，上样时硅胶量是样品量的20～40倍左右，选取柱子的标准要实际根据你样品的TLC爬板情况来，如果杂质很多挨得很近，那么尽可能选大一丢丢的柱子，使你的样品正好能铺一小薄层（建议厚度在5mm以下），如果杂质很远，这个厚度自然也可以提高，但也不建议你样品厚度超过2cm，除非这个产物就是简单冲一冲就行。
很多人会犯一个错误，就是想着我硅胶多加点，加的高高的，我样品上厚一点是不是也可以分离的很好？
这个答案是否定的！
理由是这些人从没有想过底下的样品和上面的样品不是在同一起跑线，这样只能的到一部分纯的，大部分是交叉的，过不纯不说，浪费时间浪费溶剂！
这也是为什么样品要求铺薄的原因！
选取柱子后，加入硅胶时可以通过加料漏斗，同时一定要戴上口罩在通风橱里操作，原因菜籽就不啰嗦了。
至于浸润硅胶，推荐的的流程是：先把装好硅胶的硅胶柱竖直放好，硅胶表面用手拍平，硅胶柱底部连接水泵，把硅胶抽实，然后从上面倒入极性最小的洗脱剂，到洗脱剂刚要漏下时，关闭截止阀，防止溶剂抽到水泵。
然后在加压状态，用最小的展开剂冲七八个柱体积就可以把硅胶浸润地均一。
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3、上样
上样分为湿法上样和干法上样。
湿法上样，建议的做法是——用胶头吸管吸取样品，靠近硅胶最上面切面，缓慢均匀滴加样品，直到覆盖一层，然后停止加样，给点压力让油状物沉浸到硅胶层里；油状物沉浸到硅胶层里后重复这种操作多次，直至全部上完样！
有些新同学可能好奇为什么这样操作，而不是一次性把湿法上样的油状物一次性上完呢？
其实这种操作可以减少样品层的有效高度，这时候柱层析已经开始，后面的样品相当于溶剂在推动前面的样品在硅胶里吸附、解吸附。
至于干法上样，除非万不得已菜籽是不推荐的，固体样品更推荐打浆或者结晶《歪门邪道，乙酸乙酯VS水，超声波震荡助力高沸油状物结晶》《分享一种实验室重结晶的方法》。
干法上样一般会带来两个方面的问题；一方面拌样的过程中因为要升温旋蒸，增加了样品和硅胶之间反应的可能性；另一方面干法上样就意味着样品层里会引入吸附剂，增加了样品层高度或柱子的尺寸，需要更多的时间，更多的溶剂。
如果不得已选择了，其上样直接把吸附好的粉慢慢倒进柱子就好，一些要求和湿法类似。
4、加入无水硫酸钠或石英砂
为了避免在加洗脱剂时撞击到样品层，使其不均匀，变形，影响分离效率，一般会在样品层上面铺一层无水硫酸钠或者石英砂。
菜籽个人喜欢铺无水硫酸钠，因为它还有干燥的功能，对于二氯甲烷这种易挥发吸热产生冷凝水的溶剂比较友好！
至于高度多少，就看自己的手法了！
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5，梯度洗脱，采样收集
在上样之后，菜籽个人喜欢先用小极性溶剂（基本不会让产物下去的溶剂）冲柱2-3个柱体积，确保上下均一，然后选比例洗脱。
至于过柱子的洗脱剂怎么选？
“洗脱剂的比例是你产物TLC爬板爬到Rf值约0.2时的比例。”
这是菜籽看到很多书中以及很多博主分享的过柱经验，实际过程中也大差不差，个人来讲更喜欢缩小一倍梯度洗脱。
比如如果TLC爬板展开溶剂是PE/EA=2:1，菜籽更可能从PE/EA=4:1开始梯度洗脱，洗脱到PE/EA=2:1结束，一般效果更好。
还有收集洗脱液的时候也是有技巧的，可以先选大一点的试管接收，TLC快到目标点了就换成小一点的试管，这样可以减少多接一点的可能性，不易包杂。
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如果遇到杂质点和产物点挨得比较近的情况，特别是那些荧光又比较弱的，记得不要加压，应选常压过柱，每次接半管或更少就换管，也可以提高纯化几率。
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6、柱子切忌不要及时处理！
很多新人有个习惯,过柱到了后期，TLC后面一两管没有产物，就默认柱子过完了，压干处理掉。
等到一计算收率才发现收率偏低，或者去打谱发现谱图不正确，抓错点了，后悔莫及。
所以菜籽建议您过完想要的点后柱子不要急忙处理，打核磁做收率都匹配之后再处理。
如果忙，或者急着用这根柱子纯化其他化合物，建议换大极性良性混合溶剂冲一下，把这部分洗脱液单独留下来等鉴定结果。
## 过柱可能会遇到的一些问题，列如下：
1、洗脱剂和展开剂概念
展开剂是指你TLC爬板时的溶剂比例，洗脱剂是指你过柱时用的溶剂，理论上洗脱剂的极性不应大于展开剂的极性。
但某些特殊不好溶解的产物，过柱后期洗脱剂的极性可能会大些，常用洗脱剂极性以下面顺序递增：
己烷和石油醚<环己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<<甲醇<水<乙酸
至于国外喜欢用的氯仿和乙醚，不建议使用。
2、柱前样
过柱之前一定要留柱前样，特别是比较杂的体系；同时我也建议你过柱前TLC分析时点浓一点，有些杂质太稀的体系看不到！
3、油状物选择干法上样！？
不建议，不建议，不建议！
菜籽看到很多硕士研究生这样操作，也看到过一些博士研究生这样操作，当时是懵逼状态，很不理解。
这得要多少的硅胶才能全部吸附住，本来固体只要1~2倍硅胶吸附，你这样操作最起码要十倍以上，也意味着相同柱子，柱效降低10倍以上，甚至远远不止！
如果你告诉我是因为产品固不固，液不液才这样选择，我会告诉你选方法重结晶试试！
4、用了一次的硅胶可以用大极性溶剂（如甲醇）冲柱处理一下再用吗？
不建议再使用，塔板数会降低，柱效差，分离效果也差。
举个最简单易懂的例子，擦完屁屁的卫生纸，再用你都会叠成两层，而且两层的情况下都有可能
“噗”一下弄烂了。
粘一手！
5、硅胶和溶剂会反应吗？
一般和过柱溶剂不反应，但要注意两点:
一个是有些溶剂（如二氯甲烷、石油醚） 和硅胶混合的时候会放热，对温度敏感的化合物要小心；另一个是甲醇会溶解少量硅胶，不太建议用纯甲醇这种太大极性过柱子！
6、洗脱剂选择的问题。
洗脱剂一般要根据展开剂比例选，但有时候PE/EA体系TLC不好时，可以用PE/DCM 体系试一试，说不定有更好的效果！
7、grease峰问题
柱子下面的活塞记得一定不要涂硅脂之类的润滑剂，相似相溶原理，会被淋洗剂带到产品中从而导致杂峰；如果担心漏液，建议采用四氟节门的旋塞。
8、干法上样，样品怎么准备！
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吸附时，一定要旋成粉状！
吸附时，一定要旋成粉状！！
吸附时，一定要旋成粉状！！！
重要的事情说三遍。如果没有旋成粉状，成疙瘩颗粒就上样了，运气好可能是过不纯；运气不好可能就如同上图一样产物在柱子前头析出来，如果产品溶解性好也就罢了；如果溶解性特别不好，会导致整个柱子每个地方都有产品，即使用甲醇也一直冲不下来，到时候该怎么办？
分次取出来用大量水洗涤，有机溶剂萃取吗？
实话告诉你，菜籽这么干过！
效果很差，基本上废了！
9、吸附强弱问题
硅胶对化合物的吸附性与化合物结构、官能团息息相关 ，一般含有极性较大的基团的化合物与硅胶吸附也越大，下面是根据个人经验总结的大概排序，可以参考一下：
碱和酸>醇、胺、酰胺、硫醇、酚类>酯、醛、酮>硝基化合物＞芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃 
10、如果发现柱子过杂了或选择的极性不对
建议直接换大极性溶剂直接冲下来，重新过柱，以节省时间。
11、柱子有气泡
无论正相柱还是反相柱，柱子内有气泡肯定会影响分离效率的。具体处理方法;
一是用洗脱剂反复压；
另一个就是反复拍，气泡密度影响会往上走。
12、反相柱和正相柱异同
如果过一些极性比较大的化合物如盐酸盐、碱性盐以及含有很多大极性基团的化合物，正相柱就不合适了，此时用到反向柱。
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反相硅胶具体就不科普了，但过反相柱有几点需要科普：
①有反向硅胶自然就有反相硅胶板，一般为铝板，两者价格都比较贵，所以要节省使用。
②反向柱体系可以类比HPLC，一般用甲醇-水体系，或乙腈-水体系过柱。过柱极性和正相柱相反，此体系中，甲醇大于水。
③反相柱不适用于全水体系，过完后反相硅胶要用甲醇冲洗干净，不要压干，用甲醇浸没保存
13、酸加酸、碱加碱
两个作用，一个是抑制拖尾；一个是防止分解，特别是碱性化合物如亚胺，由于硅胶是酸性的，一定要小心。
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14、选择合适的固定相
我们都知道用硅胶作固定相过柱子的原理其实是吸附与解吸的平衡。
所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，可能导致的后果就是，两个产物点，极性大的却更容易出来。
这种情况在有机合成中是经常遇到的。小编也遇到过多次，此时用氧化铝做固定相可以完美解决！
15、过柱后的产物有些毛毛刺刺的
有些固体过柱后在溶液里TLC时点板是纯的，但是旋干点浓一点就会显现出杂质，相比较再过柱一遍，我更建议你打个浆，溶剂比例选择比洗脱剂极性小一点。
16、酰氯能不能过柱子？
低级的酰氯肯定不适合，一定会分解；但是高级的固体酰氯还是比较稳定的，可以过柱子，但是我还是建议不要轻易接触水，毕竟水滴石穿！