水溶性天然产物的提取分离技术

摘要：
水溶性天然产物是药物研发中极具潜力的原料资源，分离纯化水溶性天然产物中具有独特生物活性的物质是中药研究的重要基础工作。
水溶性天然产物有效成分复杂，含量低，难于富集 用传统的分离方法不仅步骤繁琐，能源及材料消耗大，而且产率及纯度不高，尤其难以分离结构和性质相似的组分。
随着中药现代化的发展高新技术不断在水溶性天然药物中推广应用。
现将近年水溶性天然产物提取分离纯化新技术的进展作一综述。

1、传统的提取分离方法
# 1.1 　热水浸提法
热水浸提法即是煎煮法，是中药有效成分提取最早、最常用的方法之一。中国药典1990年版一部和卫生部《药品标准》中药成方制剂1～9 册，共收载中成药1945种，其中==采用热水浸提工艺的多达826 种==。
但是热水浸提法基本上仍停留在经验水平上，热水浸提法的工艺参数，如浸泡时间、煎煮时间、煎出量(药液得量) 等均无最佳量控标准，往往导致产品质量和疗效的显著性差异。
一定程度上，应当组织力量从多层次、全方位进行系统研究，选择出适合于各种成药品种的热水浸提工艺的最佳条件和质量控制标准。
# 1.2 　乙醇提取法    
乙醇浸提法原理与热水浸提法基本相同，不同之处是用乙醇作溶剂浸出中药有效成分，该法可以有效减少药材中水溶性杂质的浸出，对于这类杂质较多的药材尤为适宜。乙醇浸提法分为冷浸法(渗漏法) 和热提法(回流法) 两种。由于采用乙醇作为溶剂进行提取，某些溶解于乙醇的杂质(如树脂、油脂、色素等) 也会被提取出来。对于这些杂质，可从醇提取液中回收乙醇，加水搅拌，冷藏一段时间，待完全沉淀后过滤除去。冷浸法一般用于提取热敏性成分，但乙醇用量多，回收溶剂量大，生产周期长。热提生产周期短，但杂质含量相对较高，给后继的分离工序增加了成本
2综合提取分离技术。
# 2.1膜分离技术
膜分离技术以选择性透过膜为分离递质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，原料侧组分选择性的透过膜，以达到分离，提纯目的。膜分离技术具有过程简单、无相变、分离数大、节能、高效、无二次污染、可常温连续操作、可直接放大等优点，是一项高新技术。膜分离技术在中药领域中的应用将推动中药现代化发展进程，同时还能提高我国中药的附加值，有利于中药出口。可以展望，膜分离技术必将在世纪推动中药制药工业的迅速发展，为社会带来巨大的经济效益和社会效益。
# 高速逆流色谱分离技术
高速逆流色谱分离法是一种不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术，该技术分离效率高，产品纯度高不存在载体对样品的吸附和污染，具有制备量大和溶剂消耗少等优点，可广泛应用于生物工程、医学、医药、化工、食品等领域 。近年高速逆流色谱分离法在天然药物研究领域独具特色 。王凤美等[4]用高速逆流色谱法制备丹酚酸 B 化学对照品，所用的溶剂系统为正己烷- 乙酸乙酯- 水- 甲醇 （1.5 ：5 ：5 ：1.5）一次分离可制备 63.4 mg 丹酚酸 B， 纯度为 98.16%，同步完成复杂样品的分离、纯化和制备。    
# 2.2高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳法是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术，以高质电场为驱动力以毛细管为分离通道依据样品中各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现的类液相分离技术。该技术用于分析中草药，具有以下优势：分离模式多，适合于中草药中存在的各类物质的分析；简化对样品前处理的要求；分析时间一般比HPLC短；由于柱效高，有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分的分析；
HPCE所采用的毛细管柱易于全面清洗，不必担心柱污染而报废；所用的化学试剂少，价廉，分析成本低，特别适合于我国国情。[5]
# 超声提取
超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出、提取；另外，超声波的次级效应；如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并使之充分与溶剂混合，利于提取。其热效应、机械粉碎作用及空化作用成为超声技术在中药提取法应用中的三大理论依据。与常规提取法相比。超声波提取速度快、时间短、收率高、并免去了高温对提取成分的影响，已被许多中药分析过程选为样品处理的手段。陈洪涛等[11]研究超声提取榕树叶总黄酮的工艺条件，结果表明该方法效率高，稳定性好，提取总黄酮含量高。
# 2.3分子蒸馏技术    
分子蒸馏是在高真空度下进行分离操作的连续蒸馏，可使分离混合物的沸点远低于常压，各组分在系统中受热停留时间短，因此适于分离沸点高、黏度大、热敏性的天然物料。翟淑红等[12]利用分子蒸馏技术对茶树油进行精制，结果从粗茶树油中分离出了，61种化合物鉴定出36种组分，占总量的98.67%，其中 4-松油醇高达49.56%，并且精制的茶树油符合国际标准。分子蒸馏技术目前面临的主要课题是扩大应用领域，尤其是对一些分离难度大的天然药物的应用。
# 2.4超临界流体萃取技术
超临界流体技术是一种高新分离技术，以其过程简单、无污染、选择性好而倍受关注,尤其适用于生物资源有效成分的分离，非常符合绿色化学的发展要求。超临界流体萃取就是利用某些溶剂在临界值以上具有的特性来提取混合物中可溶性组分的一门新的分离技术，同传统的溶剂相比，它具有显著的产品回收率和纯度，改进了产品质量，降低能耗。超临界CO2萃取，其原理是在高压超临界状态下，以液态CO2作抽提溶剂进行抽提，然后减压分离，随着压力下降，液态CO2不断汽化，可分离出所要提取物的有效组分，此法具备无有机溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。其适于提取极性低的化合物，如酯、醚、内酯和含氧化合物易萃取，对于黄酮类化合物，由于酚羟基多，极性较大，萃取较难。对此，近年来采用在超临界流体中加入夹带剂的方法予以解决。童胜强等[8]采用超临界流体CO2萃取结香花中的黄酮类成分，在夹带剂的选择上，采用80%乙醇作为夹带剂能最大限度的提高黄酮类化合物的萃取率。萃取压力、萃取时间、萃取温度、萃取时CO2流量对提取率的影响作为最主要因素，选用4因素3水平的L9(3)正交实验方案，优选出萃取温度45℃、 萃取压力25MPa、萃取时间60min、动态流量2kg/h为最佳方案。
# 2.5超声提取技术    
超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出、提取。朱小霞等[9]用超声波提取树莓叶中的黄酮类物质时，以提取时间、 提取温度、乙醇浓度与料液比为四因素，设计正交试验，选出提取时间为50min， 提取温度为60℃，乙醇质量分数为60%，料液比为1：25，此条件下总黄酮物质的得率最高。冯宗帅等[10]采用超声辅助提取青钱柳叶总黄酮，采用单因素试验考察溶剂体积分数、超声处理时间、超声功率和液料比对青钱柳叶总黄酮提取率的影响，再依据单因素试验的结果确定因素水平范围，采用二次回归旋转法组合设计，共进行36次试验加以优选。隋婧等[11]利用超声波辅助技术,获得最大限度提取青蒿中总黄酮的新工艺。用正交设计理论，结合分光光度法、优化超声波辅助醇提法提取青蒿总黄酮工艺中的关键技术参数。杨洪武等[12]对黄连花中黄酮类化合物提取采用水浴与超声两种方法比较，影响黄酮类物质提取的主要条件基本相同，但超声条件下提取效果优于水浴。王丽婷等[13]对金银花叶中黄酮类物质的提取工艺采用了超声波法。
# 2.6微波提取技术
近年来，微波法因促进反应的高效性和强选择性，以及操作简便、副产物少、产率高、产物易提纯等优点，已经被广泛应用于物质的提取和有机合成、酯化等反
应。微波萃取技术原理是物料吸收微波能后，通过偶极子旋转和离子传导两种方式同时加热，加剧了体系中分子的碰撞频率，使分子容易从药材内部扩散到萃取溶剂中，大大缩短了加热时间，提高了萃取效率。高丽威等[14]用微波萃取法提取紫心甘薯总黄酮，研究探讨了紫心甘薯黄酮类化合物微波提取的最佳条件。实验中采用的是微波萃取仪，如果适当改进应用到工业生产，能有效降低生产成本， 提高经济效益，而且生产流程简单，安全可靠。    
# 2.7酶法提取技术
提取植物有效成分的过程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。选用适当的酶作用于药用植物材
料，如纤维素酶、果胶酶等，可使细胞壁及细胞间质中的纤维素、果胶质等降解， 破坏细胞壁的致密结构，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力。欧阳娜娜等[15]利用酶解与溶剂联合提取银杏叶中黄酮类化合物。科研人员对酶解原理和作用进行了深入的研究，发现纤维素酶能使细胞壁疏松、破裂，减小传质阻力，促使黄酮类化合物向溶剂主体扩散，从而完成提取传质过程，提高提取效率。该课题研究了缓冲液pH值、酶解浓度、酶解温度、酶解时间等因素对得率的影响，优选出酶解预处理与溶剂提取相结合的
最佳工艺条件，结果得出酶通常在45-55℃下活性最好，温度过低酶活性降低， 温度过高却使酶蛋白变性失活，丧失催化能力。
# 2.8溶剂萃取技术
用水或不同浓度的醇提得到的浸出物成分复杂，往往不能析出黄酮类化合物。需用不同极性溶剂相继萃取，能使苷与苷元分离（或使极性苷元与非极性苷元分
离）。钟胜佳等[16]对油松松针中的黄酮类成分的提取，采用等体积的石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取的分离方法。郑岩等[ 1 7 ]在鸡血藤黄酮类化合物的研究中，将鸡血藤藤茎粗粉10kg，提取后依次用石油醚，醋酸乙酯和正丁醇萃取，得95％乙醇提取物的石油醚萃取物30g，醋酸乙酯萃取物400g，正丁醇萃取物84g，70％乙醇提取物的醋酸乙酯萃取物17g，正丁醇萃取物346g。陈婷婷等[18]选用有机溶剂提取法，通过单因素及正交试验确定了绿豆皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺。    
# 2.9聚酰胺技术
聚酰胺对黄酮类化合物有很好的分离效果，且其容量比较大，适合于制备性分离。聚酰胺色谱的分离机理，一般认为是“氢键吸附”，即聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生的，其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子上的酚羟基的数目与位置，及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合能力越强，则聚酰胺对黄酮类化合物的吸附作用将越弱。李俊松等[19]采用聚酰胺吸附法纯化甘草总黄酮，其纯度达45％，总黄酮收率达90％。
# 2.10大孔吸附树脂技术
 大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,应用大孔树脂进行分离的技术是20世纪 60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔树脂的孔径与比表面积都比较大,在树脂内部具有三维空间立体孔结构,由于具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、 解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、 宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，近年来广泛用于天然产物的提取分离工作中,得到了普遍认可和重视。近年来，大孔吸附树脂已广泛应用于天然产物中黄酮类化合物的分离纯化。大孔吸附树脂是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成的一类有机高聚物吸附剂。从吸附性能来说,它具有理化性质稳定，不溶于酸、 碱及有机溶剂，不受无机物影响等众多优点，因而近几年在天然产物的分离纯化中被广泛应用。丁彩丽等[20]采用6种大孔吸附树脂，比较其对款冬花总黄酮的吸附量、解吸率及吸附动力学特性，筛选出较优的款冬花黄酮吸附树脂。陆英等[21]用大孔树脂分离纯化鼠曲草中黄酮类化合物。邓亚宁等[22]用D-101型大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮。游本刚等[23]采用大孔吸附树脂对珍珠菜总黄酮的分离纯化工艺进行研究。王婷婷等[24]研究了AB-8和H103两种大孔吸附树脂对丰城鸡血藤总黄酮的吸附特性，筛选出适合丰城鸡血藤总黄酮分离纯化的树脂，并对其进行了动态吸附特性研究。    
# 2.11固相萃取技术
固相萃取（solid-phase）是一种利用高效、高选择性的固定相对液态或溶解后的固态样品进行萃取、富集、浓缩、净化及相转换等样品处理的简便、经济、快速的新方法。该方法操作简单，所需样品体积较少，显著减少溶剂的用量，样品不易被污染，且固相萃取柱（SPE柱）能够再生，从而成为分析实验中常用的既快速又灵活的一种样品前处理方法。黄丽婕等[25]研究建立了用固相萃取法纯化罗汉果样品液后直接进行HPLC测定的方法。本文仅对在实践中应用广泛的提取分离方法做一综述。
随着科技的不断发展，将会涌现出更多方便、有效的方法，在具体的实验和生产工艺中，应根据实验和生产的许多研究表明，以上这些新技术在天然药物提取分离方面具有广泛的应用前景。现代化提取分离技术的应用对提高天然药物制剂质量，加快新药开发和中药现代化起着至关重要的作用。

【参考文献】
[1] 谭秦莉， 刘冬， 李玉宝， 等． 总黄酮化合物药理作用
研究进展[J]． 安徽中医学院学报,2009,28(3)：62-64．
[2] 朱海扬， 曾慧兰． 黄酮类化合物药理作用的研究进展[J]． 山东医药,2009， 49 （17）：114-115. 
[3] 华辉， 郭勇． 黄酮类化合物药理研究进展[J]． 广东药学， 1999， 9 （4）：9-12．
[4] 肖崇厚． 中药化学[M] .上海：科学技术出版社，1997.279．
[5] 李俊松， 徐德生，冯 怡， 等． 甘草中黄酮的纯化方法
和含量测定[J]． 中成药， 2007， 29 （7）：997-1000．
[6] 梁英， 韩鲁佳， 任成才， 等． 黄芩黄酮浸提工艺优化研究[J]． 中成药， 2008， 30 （7）：1068-1070．揭金阶． 罗布麻叶总黄酮类化合物的提取及含量测
[7] 王凤美,陈军辉,李磊,等.高速逆流色谱法分离制备丹酚酸 B[J].天然产物研究与开发,2006,18(1):100-104.
[8] 全亚君.高效毛细管电泳在中药分析中的应用[J].中国药物与临床,
2007,7(1):58-60.
[9] 陈洪涛,蔡丹昭,林立波.榕树叶总黄酮超声提取工艺条件的研究[J].时珍国医国药,2008,19(8):1955-1957.
[10] 翟淑红,黄少烈,顾志伟.茶树油的分子蒸馏精制及其 GC/MS 分析[J].广东化工,2008,35(1):97-100.
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