第五章迷迭香提取物抗氧化活性测定

为了评定制得产品的抗氧化性能，本章对产品P1-2、产品P2-1和产品P2-2进行了抗
氧化测试，选用抗坏血酸作为参照[43，44]。
5.1实验试剂
磷酸氢二钠
磷酸二氢钠
AR
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
中国上海试剂一厂
AR
AR
AR
三氯乙酸
三氯化铁
三羟甲基氨基甲烷
三氯甲烷
AR
AR
硫代硫酸钠
AR
AR
AR
AR
铁氰化钾
抗坏血酸
上海四赫维化工有限公司
天津市永大化学试剂开发中心
无水碳酸钠
5.2实验设备
分光光度计
721
上海第三分析仪器厂
日本岛津公司
紫外可见分光光度计
UV-2550
5.3实验方法
迷迭香酸是迷迭香中的一种有一定生理活性的酚酸类化合物，其结构特点是两个苯
环上有四个-OH，是迷迭香中一种有效的抗氧化成分。

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迷选香中迷迭香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
5.3.1三氯化铁-铁氰化钾比色法测定迷迭香酸产品的还原能力
(1) 主要溶液的配制
①B液(0.2molL"磷酸氢二钠溶液) ：
100mL；
7.16g磷酸氢二钠固体溶于水中，定容至
② D液(0.2molL"磷酸二氢钠溶液) ：3.12g磷酸二氢钠固体溶于水中， 定容至
100mL。
③0.2molL"磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline， PBS) ：取B液37.5mL与D
液62.5mL混合， 则得0.2molL'PBS， pH试纸测得其pH=6.0~6.5.
④1%铁氰化钾溶液：取约1g铁氰化钾固体，用水溶解，定容至100mL。
⑤10%三氯乙酸溶液：取约11.1g三氯乙酸，用水溶解，定容至100mL。
⑥0.1%三氯化铁溶液：取0.05g三氯化铁固体，用水溶解，定容至50mL。
⑦迷迭香酸储备液：称取1.0g迷迭香酸产品P12，用水溶解，定溶至100mL，则
其浓度为10mgmL.
迷迭香酸工作液a：分别取1，2，3，4，5mL迷迭香酸储备液，稀释成100mL，
⑧
得到浓度分别为0.1mgmL'l， 0.2mgmL'， 0.3mgmL"， 0.4mgmL"， 0.5mgmL"的迷
迭香酸工作液。
抗坏血酸储备液：称取1.0g抗坏血酸，用水溶解，定溶至100mL，则其浓度为
⑨
10mgmL'。
① 抗坏血酸工作液a：
分别取1，2，3，4，5mL抗坏血酸储备液，稀释成100mL，
得到浓度分别为0.1mgmLl， 0.2mgmL"， 0.3mgmL"， 0.4mgmL'， 0.5mgmL"的抗
坏血酸工作液。
(2)抗坏血酸还原能力的测定
取2.5mL抗坏血酸工作液置于10mL比色管中， 依次加入2.5mL 0.2molL"磷酸盐
缓冲液(Phosphate buffer saline， PBS， pH=6.0~6.5) 和2.5mL 1%铁氰化钾溶液， 摇匀，

取上清液2.5mL置于5mL比色管中，依次加入3mL蒸馏水，0.5mL0.1%三氯化铁溶液，
充分混匀， 静置10min后， 在700nm下测定其吸光度值A(以水代替抗坏血酸工作液
作为参比)[45]
o
测定不同浓度抗坏血酸工作液的吸光度值，吸光度值越高还原力越强。
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迷达香中迷迭香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
(3)迷迭香酸的样品还原能力的测定
用迷迭香酸的样品液代替抗坏血酸工作液，按上述方法测定它们的吸光度值A.
5.3.2迷迭香酸产品对超氧阴离子自由基清除能力测定
(1)主要溶液的配制
①0.1molL"Tris溶液：每100mL称取1.211g三羟甲基氨基甲烷(Tris) ， 该溶液易
从空气中吸收CO2，应密封保存。
②0.05mo 1/LpH 8.2Tris-HC 1缓冲液：50mL 0.l molL"Tris溶液与22.9mL 0.1
molL"盐酸混匀后， 加水稀释至100mL。
③)迷迭香酸工作液b：分别取2，4，6，8，10，12，14，16mL迷迭香酸储备液，
稀释成100mL， 得到浓度分别为0.2mgmL'， 0.4mgmL'， 0.6mgmL'，
1.0mgmL， 1.2mgmL'l， 1.4mgmL''， 1.6mgmL'的迷迭香酸工作液。
④ 抗坏血酸工作液b：分别取1，2，3，4，5，6，7，8mL抗坏血酸储备液，稀释
成100mL， 得到浓度分别为0.1mgmL'， 0.2mgmL'， 0.3mgmL'， 0.4mgmL""， 0.5
mgm L'， 0.6mgmL'， 0.7mgmL"'， 0.8mgmL"的抗坏血酸工作液。
(2)抗坏血酸超氧阴离子自由基清除能力的测定
0.8mg'mL"'，
取4.50mL 0.l molL""Tris-HC 1缓冲液(pH 8.2) ， 依次加入1.00mL2mmolL"乙二胺
四乙酸钠(EDTA) 溶液， 1.00mL抗坏血酸溶液， 4.20mL水， 混匀， 于25℃水浴10min，
再加入25℃预热过的100uL9mmolL邻苯三酚(对照管用10mmolL"盐酸代替) ， 加入
时计时， 混匀， 准确反应3min后， 加入50uL100mmolmLL-抗坏血酸溶液， 终止反
应，在425nm测定吸光度值A。4647]
(3)迷迭香酸的样品超氧阴离子自由基清除能力的测定
用迷迭香酸的样品液代替抗坏血酸工作液，按上述方法测定它们的吸光度值
As。
清除率=Ao-As x 100
(5-1)
Ao
5.3.3POV法测迷迭香脂溶性抗氧化剂的抗氧化能力
油脂在储藏期间，由于光、热、空气中的氧，以及油脂中的水和酶的作用，常会发

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迷香中迷达香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
生变质腐败的复杂变化，这种变化称为酸败。在酸败氧化过程中生成过氧化物和氢过氧
化物等中间产物，它们很容易分解而产生挥发性和非挥发性脂肪酸、醛、酮和醇等，这
些酸败产物常具有特殊的臭气和发苦的滋味，以致影响了油脂的感官性质。因此，检验
油脂中是否存在过氧化物、醛、酮等，以及它们的含量大小，即可判断油脂是否酸败和
酸败的程度48]。
油脂在氧化酸败过程中产生的过氧化物很不稳定，氧化能力较强，能氧化碘化钾为
游离碘。用硫代硫酸钠溶液滴定，根据析出碘量计算过氧化值，以活性氧的毫克当量来
表示。其反应为：
CH一CH一+2KI-
K20+12+—CH—CH一
0
0
0
1+2Na2S203→→
Naz S 406+2NaI
油脂中加入的一定浓度的抗氧化剂能够消灭部分过氧化物，使得游离碘的生成量减
少，滴定所用的硫代硫酸钠溶液体积也随之减少，从而油脂的过氧化值也将减小。过氧
化值越小，说明抗氧化剂的抗氧化能力越强。
本实验采用测定油脂过氧化值的方法来评价脂溶性抗氧化剂的抗氧化能力，并比较
脂溶性抗氧化剂P2-1和脂溶性抗氧化剂P2-2的抗氧化效果。
主要溶液的配制
①0.1molL硫代硫酸钠储备液：称取13g硫代硫酸钠固体， 溶于500mL水中，
缓缓煮沸10min， 冷却， 加无水碳酸钠0.1g， 摇匀， 过滤后置于棕瓶中保存， 静置两个
星期后使用，使用前对其浓度进行标定。
硫代硫酸钠工作液：取已标定过的0.1molL硫代硫酸钠储备液100mL， 稀释
②
至1000mL。
③0.1molL"硫代硫酸钠储备液的标定：
称取于120℃烘至恒重的重铬酸钾0.15g，准确至0.001g，置碘量瓶中，加入25mL
水， 2g碘化钾和20mL 20%硫酸， 摇匀， 暗处放置10min。随后加入150mL水， 用配制

好的硫代硫酸钠工作液滴定，近终点时加入3mL5gL"的淀粉指示液，继续滴定至溶液
由蓝紫色变为亮绿色。同时作空白试验(不加重铬酸钾的滴定试验)。
该硫代硫酸钠储备液的浓度按下式计算：
mx1000
(5-2)
c=
(V-V)x49.03
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迷选香中迷选香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
式中：m一重铬酸钾的质量，g；
Vi一硫代硫酸钠工作液的用量，mL；
V2一空白试验硫代硫酸钠工作液的用量，mL；
49.03一1/6重铬酸钾的摩尔质量， g/mol.
④5g100mL淀粉溶液：称取1.0g可溶性淀粉，加10mL水，搅拌下注入事先煮
沸的200mL水中， 再微沸2min， 静置15min后， 取上层清液使用。使用前制备。
⑤20%硫酸：硫酸(p=1.84gmL") 约59.8mL， 用水稀释至500mL。
⑥ 饱和碘化钾溶液：取300g碘化钾，加入150mL水，充分振摇，储于棕瓶中，
低温保存。
0.1g100mL"迷迭香酸抗氧化剂添加液：准确称取0.1g迷迭香酸抗氧化剂，溶
⑦
于适量95%乙醇，用95%乙醇定容至100mL。
⑧0.1g100mL"抗坏血酸添加液：准确称取0.1g抗坏血酸，溶于适量95%乙醇，
用95%乙醇定容至100mL。
⑨ 油样的制备：
实验所制备的油样包括不添加抗氧化剂的对照样，添加一定浓度迷迭香抗氧化剂的
测试样和添加一定浓度市面上常见抗氧化剂(这里选用抗坏血酸)的对照样。参照中国
规定的抗氧化剂BHA、BHT的最高用量(0.02%) 规定49， 本实验选取的迷迭香抗氧
化剂添加量为0.02%。
0号油脂样品：不添加抗氧化剂的油样20g，植物油脂样品和动物油脂样品分别标
为01-0和02-0号。
1号油脂样品：油样20g，加入0.1g100mL产品P2-1添加液4.0mL，则该油样中脂
溶性抗氧化剂的含量为0.02%，植物油脂样品和动物油脂样品分别标为01.1和02-1号。
2号油脂样品：油样20g，加入0.1g100mL产品P2-2添加液4.0mL，则该油脂样
品中脂溶性抗氧化剂的含量为0.02%，植物油脂样品和动物油脂样品分别标为01.2和
O2-2号。
3号油样：油样20g，加入0.1g100mL"抗坏血酸添加液4.0mL，则该油脂样品中
抗坏血酸的含量为0.02%，植物油脂样品和动物油脂样品分别标为01-3和02-3号。
(2)油脂过氧化值测定方法

称取1g添加抗氧化剂的油样，置于锥形瓶中，加入10mL三氯甲烷，溶解油样，
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迷运香中速香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
再加入15mL乙酸和1mL饱和碘化钾溶液， 迅速盖好瓶盖， 摇匀溶液1min， 在室温下
避光静置5min。再加入约75mL水， 加入3mL左右5g100mL"淀粉溶液作为指示剂，
用硫代硫酸钠工作液滴定析出的碘，以试液颜色由蓝紫色正好转成无色为终点。滴定过
程用力振摇。同时以不加油样的试液作空白滴定试验[5051]
油样过氧化值按下式计算：
POV(mmol kg) -%-y xc
-x1000
(5-3)
式中：V一试样用去的硫代硫酸钠工作液体积，mL；
Vo一空白试验用去的硫代硫酸钠工作液体积，mL；
c一硫代硫酸钠工作液的浓度， molL'；
m一油样质量，g。
5.4结果与讨论
5.4.1三氯化铁-铁氰化钾比色法测定迷迭香酸产品的还原能力
还原力的测定是检验样品是否为良好的电子供应体，它不仅使Fe*变成Fe2+，而且
还给自由基提供H，使它变成更稳定的物质。按5.3.1的方法测得迷迭香酸产品P1.2与抗坏
血酸在不同浓度的还原力如图5-1。
一reducing power of RosA
-k-reducing power VitC
2
1.5
0.5
0
0.6
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
C/mgm L'

图5-1迷迭香酸产品P-z和抗坏血酸不同浓度的还原力
Fig.5-1 The change of reducing power of RosA P-z and ascorbic acid along wth concentration
从图5-1可以看到，随着迷迭香酸和抗坏血酸浓度的增加其还原力也随着增大，抗
坏血酸的还原能力要强于迷迭香酸产品的还原能力。
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迷迭香中迷迭
香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
5.4.2迷迭香酸产品对超氧阴离子自由基清除能力测定
按照5.3.2的方法测定迷迭香酸产品P1-2和标准物抗坏血酸清除超氧阴离子自由基
的能力，见图5-2和5-3.
100
80
60
40
20
0
9810
c/gL"'
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
图5-2迷迭香酸产品清除超氧阴离子能力随浓度变化曲线
Fig.5-2 The superoxide anion radical-scavenging activity of the RosA P 1-z along with concentration
100
一
o
80
60
40
20
cc
105060.708.9
0.6
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
C/g·L"
图5-3抗坏血酸清除超氧阴离子能力随浓度变化曲线
Fig.5-3 The superoxide anion radica-scavenging activity of ascorbic acid along with concentration
由图5-2和5-3可以看出，在所测浓度范围内，迷迭香酸产品P1.2和抗坏血酸对超
氧阴离子自由基的清除能力随浓度的增加而增大，但迷迭香酸的清除超氧阴离子自由基
的能力不如抗坏血酸。抗坏血酸清除超氧阴离子的能力随浓度变化快，在0.6gL"时随
浓度的增加而增大已经达到80%以上，而迷迭香酸产品P1-2清除超氧阴离子的能力虽然

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迷迭香中迷香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
阴离子的清除率只有20%。
5.4.3迷迭香脂溶性抗氧化剂抗氧化能力测试
5.4.3.1在植物油中的抗氧化能力测试
将油样(01-0、01-1、012、013)装于锥形瓶，放入可控温的烘箱中，使温度控制在
70±1℃，放松瓶盖使空气进入瓶内以加快油脂的氧化速度，植物油每隔24h取样测定
其过氧化值。在测定花生油过氧化值变化的过程中发现，在96h以后，所有油样的过氧
化值都已超过植物油衰败的临界点(70mmolkg") ， 故油样过氧化值的测定到第96h为
止。得到各植物油样POV(mmol kg") 一时间(h) 的相关曲线如图5-4。
250
01-0
200
-oEE>a
150
0-3
0-2
100
0-
50
0
24
48
72
96
Time/h
图5-4抗氧化剂对花生油过氧化值的影响
Fig.5-4 The effect of antioxidant on peanut oil
由图5-4可以看出。
①与不添加任何抗氧化剂的油样01-0相比，添加了抗氧化剂(其浓度为0.02%)
后的油样的过氧化值随着时间的延长增加的速度明显缓慢，这说明两种迷迭香抗氧化剂
和抗坏血酸都在花生油中都起到了延缓油脂氧化的作用。
②与添加了对照抗坏血酸的油样01-3相比，添加了相同浓度(0.02%)迷迭香抗氧

化剂的油样01.1和O1-2的过氧化值增加速度比较慢，这说明迷迭香脂溶性抗氧化剂在花
生油中的抗氧化能力要强于抗坏血酸。
③)添加了相同浓度(0.02%)迷迭香抗氧化剂P2-1的油样01.1和迷迭香抗氧化剂
P-2的油样O1-2相比，油样O1的过氧化值增加速度比油样01-1的过氧化值增加速度略
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迷香中迷选香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
快，已知迷迭香抗氧化剂P2-1中的鼠尾草酸含量大于鼠尾草酚，迷迭香抗氧化剂P2-2中
的鼠尾草酸含量小于鼠尾草酚，所以产生此实验效果的原因可能是在植物油中的抗氧化
能力鼠尾草酸是大于鼠尾草酚的。
5.4.3.2在动物油中的抗氧化能力测试
将油样(O20、O2-1、02-2、O2-3)放入可控温的烘箱中，使温度控制在70±1℃，放松
瓶盖使空气进入瓶内以加快油脂的氧化速度，动物油每隔12h取样测定其过氧化值。在
测定猪油过氧化值变化的过程中发现，在36h以后，所有油样的过氧化值都已超过动物
油衰败的临界点(20mmolkg) ， 故油样过氧化值的测定到第36h为止。最后得到各动
物油样POV(mmol kg") 一时间(h) 的相关曲线如图5-5所示。
200
0209
160
EE>Oa
120
023
80
40
0
022
0
0
12
24
36
Time/h
图5-5抗氧化剂对动物油过氧化值的影响
Fig.5-5 Effect of antioxidant on creat ural lipid
由图5-5各个猪油样的过氧化值变化曲线，可以得出如下结论：
①与不添加任何抗氧化剂的油样O2-0相比，添加了抗氧化剂(其浓度为0.02%)
后的油样的过氧化值随着时间的延长增加的速度明显缓慢，这说明两种迷迭香抗氧化剂
和抗坏血酸都在猪油中都起到了延缓油脂氧化的作用。
②与添加了对照抗坏血酸的油样02-3相比，添加了相同浓度(0.02%)产品O2-1
和产品O2的过氧化值增加速度更慢，这说明两种迷迭香脂溶性抗氧化剂在猪油中的抗
氧化能力要强于抗坏血酸。
③添加了相同浓度(0.02%)产品P2-1的油样O2-1和添加了产品P2的油样022的
过氧化值增加速度相当，推断原因可能是鼠尾草酸在动物油中的抗氧化能力与鼠尾草酚

相当。
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迷迭香中迷逸香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
5.5小结
实验室制得的迷迭香酸产品P1-2、脂溶性抗氧化剂产品P2-1和P2-2进行了抗氧化测
试，实验结果表明都具有一定的抗氧化能力：
(1)实验用三氯化铁-铁氰化钾比色法测定了产品P1-2的还原能力，随着产品P1.2和
抗坏血酸浓度的增加其还原力也随着增大，并且抗坏血酸的还原能力要强于产品P12的
还原能力，产品P1-2和抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除能力随浓度的增加而增大，
但P1.2的清除超氧阴离子自由基的能力不如抗坏血酸。
使用抗氧化剂时，并不是活性越强越好，应根据抗氧化过程的长短来选择活性恰当
的抗氧化剂，迷迭香酸的优良抗氧化性能及纯天然的优势必将在食品及保健品、化妆品
领域有着更广阔的应用前景。
(2)用油脂过氧化值的方法测定了产品P2-1和产品P2-2在动物油和植物油中的抗氧化
能力，两种迷迭香抗氧化剂和抗坏血酸都在动物油和植物油中都起到了延缓油脂氧化的
作用，迷迭香脂溶性抗氧化剂在两种油中的抗氧化能力要强于抗坏血酸。其中在植物油
中产品P2-1的抗氧化能力略高于产品P2-2的抗氧化能力，而在动物油中两种脂溶性抗氧
化剂的抗氧化能力相当。进一步验证了脂溶性抗氧化剂的主要成分没有因为微波辐射而
导致破坏。

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迷迭香中迷迭香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
第六章结论与展望
本文通过对物迷迭香中迷迭香酸的提取、纯化及提取物的抗氧化能力测试等实验，
得出如下结论：
(1)在常规热回流提取工艺的基础上，研究了超声波辅助微波法提取迷迭香酸的新
工艺，得到实验室提取迷迭香酸的最佳工艺条件为：迷迭香干叶破碎至20目，用15%
乙醇作溶剂， 料液比为1：5(w/v) ， 超声波预处理10min， 然后进行微波法提取， 微波功
率为540W， 辐射时间为6min， 共辐射4次。该生产工艺改进了迷迭香酸的提取工艺，
采用超声辅助微波法提取，整个提取工艺设备简单可行，提取工艺很大程度地缩短了提
取时间、减少了溶剂用量、降低了能耗，并且迷迭香酸提取率比常规法的提取率都要高，
表现出明显的优势，为迷迭香酸的工业化提取提供了理论依据。
(2)迷迭香中迷迭香酸的纯化工艺：提取液首先选用0.2um陶瓷膜进行微滤，除去
悬浮颗粒及大部分的果胶、蛋白；然后用X-5大孔树脂富集迷迭香酸；富集后的料液选
用正丁醇为萃取剂进行萃取可得纯度为73.29%的迷迭香酸产品P1-1；最后通过结晶得到
迷迭香酸产品P1-2，纯度可达96.82%。整个纯化工艺流程简便，能耗低，所得迷迭香酸
产品纯度高为迷迭香酸的生产提供了新方法。
(3)利用提取完迷迭香酸的料渣提取脂溶性抗氧化剂，抗氧化剂得率可达9.17%。
脂溶性抗氧化剂的主要成分没有因为微波辐射而导致结构破坏，对用鲜叶和提取过迷迭
香酸的料渣制得的产品P2-1和P2-2进行抗氧化对比实验，发现两种抗氧化剂都具有抗氧
化性，在植物油中产品P2-1的抗氧化能力略高于产品P22，而在动物油中两种脂溶性抗
氧化剂的抗氧化能力相当。利用料渣继续提取脂溶性抗氧化剂，完善了迷迭香的综合利
用。
(4)实验用三氯化铁-铁氰化钾比色法测定了制得迷迭香酸产品的还原能力，用邻苯
三酚法测定了清除超氧阴离子自由基的能力，发现迷迭香酸产品抗氧化性能良好，其优
良抗氧化性能及纯天然的优势必将在食品及保健品、化妆品领域有着更广阔的应用前
景。
由于实验条件和时间的限制，还有很多工作需要进一步完善：富集迷迭香酸的树脂
还需进一步优化筛选，寻找出对迷迭香酸富集效果更好的树脂，同时迷迭香酸进行结晶

纯化的条件也应进一步探讨，使迷迭香酸生产工艺条件更稳定可靠，产品纯度更高。
49