第二章迷迭香中迷迭香酸提取工艺的研究

提取是研究天然产物的一个重要步骤，是采用适宜的溶剂和适当的方法，将所要的成分尽可能完全地从天然药物中提取出来，同时注意避免或减少其它杂质的提出。
本章探讨了迷迭香酸的提取工艺，为进一步更加有效地开发和利用迷迭香酸提供了方法。
# 2.1实验原料
迷迭香鲜叶产于广西百色市西林县
# 2.2 实验试剂
迷迭香酸标准品
乙醇
纯度≥98%
美国西格玛公司
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
广东西陇化工厂
95%，AR
盐酸
AR
AR
乙酸乙酯
# 2.3实验设备
紫外可见分光光度计
旋转蒸发器
UV-2550
RE-52A
日本岛津公司
上海亚荣生化仪器厂
微波炉
WD900CSL 23一2
SB-80
广东格兰仕企业集团
宁波新芝生物科技股份有限公司
超声波清洗机
# 2.4实验方法
==溶剂提取法与超临界流体萃取法相比，具有简单易行，对设备要求较低的优点。==
## 2.4.1原料的预处理
将迷迭香鲜叶经水蒸汽蒸出精油后，经干燥、粉碎、过筛后保存备用。
## 2.4.2常规热回流法提取迷迭香酸
考虑了粉碎度、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间及料液比对迷迭香酸提取率的影响。
称取50g原料，置于1000ml圆底烧瓶中，以一定的料液比加入水及不同浓度的乙醇，在一定温度一定时间下热回流提取并过滤，共提取6次，将提取的滤液合并后浓缩回收乙醇，用蒸馏水定容到100ml，用1：1的盐酸调节pH值至2.0~2.5之间。
按照料液溶剂比5：3(v/v) 加入乙酸乙酯萃取3次， 合并萃取液， 用FeSO4比色法测定， 经计算得到提取率。
## 2.4.3微波法提取迷迭香酸
微波萃取又称微波辅助提取，是指使用适合的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。微波萃取技术可以缩短实验和生产时间、降低能耗、减少溶剂用量以及废物的产生，同时可以提高收率和提取物的纯度；降低实验操作费用和生产成本。用微波萃取技术提取天然药物的化学成分具有很高的实用价值，有待开展多方面的深入研究[35]。目前还没有微波辅助提取迷迭香酸的工艺报道。
利用微波法提取迷迭香酸，考虑了微波辐射时间、微波功率、微波辐射次数等因素的影响。称取50g原料，置于1000mL圆底烧瓶中，加入水及不同浓度的乙醇，以浸过原料表面2cm为度，料液比为1：5，于一定功率，辐射一定时间，共辐射6次，冷却后过滤，滤液合并后浓缩回收乙醇，用蒸馏水定容到100mL。用1：1的盐酸调节pH值至2.0~2.5之间。按照料液溶剂比5：3(v/v) 加入乙酸乙酯萃取3次， 合并萃取液， 用Fe SO 4比色法测定，经计算得到提取率。

## 2.4.4超声波辅助微波法提取迷迭香酸
由于超声波具有振动空化、机械粉碎、搅拌等作用，特别是以振动空化这一独特作用形式在液体内部产生强的冲击波和微射流，出现局部的高温、高压，导致多次级效应，如击碎、乳化、扩散、强烈的机械振荡等，加速体系的传质、传热等过程。使植物组织中的细胞破裂，更利于溶剂渗透到植物细胞内部，增加了迷迭香酸在溶剂中的溶解，超声时间、超声强度是影响提取效率的重要因素[36]。在本实验中主要考查了超声时间对提取率的影响。
在微波法提取迷迭香酸的最优条件下，加以超声波辅助破壁，考虑了超声时间对迷迭香得率的影响。按照Fe SO 4比色法测得迷迭香酸的提取率。
## 2.4.5迷迭香酸提取率的计算
Fe SO 4比色法37：从总萃取液中取1.0mL待测样品放入一干燥试管中， 自然挥干乙酸乙酯； 向试管中加1.0mL 0.1molL醋酸钠溶液(NaAc， pH 6.0) ， 封口后在50℃水浴中溶解提取物， 再加0.1molL”醋酸钠溶液3.97mL， 后加入30pL新配的0.2molL"
硫酸亚铁(Fe SO 4) 溶液， 暗处反应60min， 以不加Fe SO 4而加30uL水的上述液体为对照，于572nm处比色测得吸光度A；迷迭香酸的提取率n的计算可用下式表示：
-Cx1
-×100%
C×V总
(2一1)
根据朗伯-比耳定律：
A=ebC
所以
(2--2)
(2一3)
c=_4
eb
由于： (吸光系数)、b(液层厚度)为常数，所以
C xV
A xV
-×100%=
-×100%
(2-4)
n=
Ca xV a
Aax Ve
# 2.5结果与讨论
## 2.5.1常规热回流法提取迷迭香酸
考虑了粉碎度、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间及料液比对迷迭香酸提取率的影响。
(1) 原料粉碎度对提取率的影响
分别称取50g粉碎度为10、20、30、40目的迷迭香干叶，加入10%的乙醇，液料比为6：1，在65℃下热回流提取6次，由2.4.5计算提取率，实验结果如图2-1.
96
95.5
95
94.5
94
93.5
93
92.5
10
15
20
25
30
35
40
45
Comminuted size/mesh
图2-1原料粉碎度对提取率的影响
Fig.2-1 The effect of comminuted size on extracting ratio
由图2-1可见，在粉碎度为20目以下时，迷迭香酸的提取率随粉碎度的增加而迅速提高，在粒度大于20目，随着粉碎度的继续增加，提取率增长缓慢。由于随着粉碎度的增加，会使迷迭香叶中其它可溶性物质大量溶出，而且提取液过滤困难，因此，确定==20目为最佳粉碎度==，以下实验均固定使用20目的迷迭香干叶。
(2)乙醇浓度的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，分别加入蒸馏水和浓度为5%、15%、25%、35%的乙醇，液料比为6：1，在65℃下热回流提取6次，由2.4.5计算提取率，实验结果
如图2-2所示。
95
94.5
94
93
92.5
92
0
5
10
15
20
Ethanol concentration/%
25
30
35
40

图2-2乙醇浓度对提取率的影响
Fig.2-2 The effect of ethanol concentration on extracting ratio
实验结果表明，乙醇浓度在15%以下时提取率呈增长趋势，随后随着乙醇浓度的提高，提取率开始缓慢降低，同时由于乙醇浓度增大，会将迷迭香中的脂溶性物质也溶解出来，所以选择乙醇的提取浓度为15%。
(3)液料比的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，先后采用4：1，5：1，6：1，7：1，8：1的液料比加入15%的乙醇，控制温度为65℃，每次提取1h，连续提取6次，由2.4.5计算提取率，实验结果如图2-3所示。
96
94
92
x
90
88
86
4
5
6
7
8
Liquid to solid ratio
图2-3液料比对提取率的影响
Fig.2-3 The effect of liquid to solid ratio on extracting ratio
由图2-3可见，迷迭香酸的提取率随着液料比的提高而逐渐升高。当液料比达到7：1时得率较高，与液料比8：1相比几乎一致。从成本考虑，选择7：1溶剂用量，因此选择==7：1为最佳料液比==。
(4)浸提温度的选择
的液料比可以减少提取称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，加入15%的乙醇，液料比为7：1，控制温度分别为25℃、45℃、65℃、85℃、105℃下热回流提取6次，每次提取1h，由2.4.5计算提取率，实验结果如图2-4所示。
100
90
ox 80
70
60
50
40
30
20
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Extracting temperature/℃
图2-4提取温度对提取率的影响
Fig.2-4 The effect of extracting temperature on extracting ratio

由图2-4可以看出，在45℃~85℃范围内迷迭香酸的提取率随温度的增加而提高

迷选香中迷选香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究在85℃时提取率达到最大，在85℃之后随着温度的增大反而降低。因此，提取==温度以85℃为佳==。
(5)浸提时间的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，加入15%的乙醇，液料比为7：1，在温度为85℃下热回流提取6次，每次提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，由2.4.5计算提取率，浸提时间对提取率的影响如图2-5所示。
95
o
93
91
89
87
0.5
1.5
2
2.5
3
Extracting time/h
图2-5浸提时间对提取率的影响
Fig.2-5 The effect of extracting time on extracting ratio
由图2-5可以看出，浸提时间为1h时浸提率达到最高，但随着浸提时间增加，可能会使物质结构破坏，其提取率反而降低。因此，选择的==提取时间为1h==。
(6)提取次数的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，加入15%的乙醇，液料比为7：1，在温度为85℃下热回流提取，每次提取时间分别为1h，提取次数分别为1，2，3，4，5，6次，由2.4.5计算提取率，浸提次数对提取率的影响如图2-6所示。
100
90
ox
80
70
60
50
40
0
2
3
4
5
6
7
Extracting times
图2-6浸提次数对提取率的影响

速迭香中迷迭香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究从以上实验数据看出，随着提取次数增多，时间的延长，迷迭香酸的提取率随之增长，但前4次迷迭香酸的提取率总和已达94.37%，从节能、生产成本等方面综合考虑，故实验选取提取次数为4次。

综上所述，得到常规热回流提取法最佳的提取条件为：==物料破碎至20目，用15%乙醇溶液，在料液比为1：7(w/v)，提取温度为85℃的条件下，提取4次，每次为1h。得到迷迭香酸的提取率为94.37%。==
## 2.5.2微波法提取迷迭香酸
在常规热回流法提取条件的基础上，加入15%的乙醇，以浸过原料表面2cm为宜，此料液比为1：5，试验微波辐射次数、微波辐射功率、微波辐射时间等因素对迷迭香酸提取率的影响[38].
(1)微波辐射功率的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，加入15%的乙醇，料液比为1：5，控制微波输出功率分别为180W、360W、540W、720W、900W， 每次连续辐射3min， 共辐射6次，由2.4.5计算提取率，微波辐射功率对提取率的影响如图2-7所示。
93
ox 92
91
90
89
88
87
150
250
350
450
550
650
750
850
950
Microwave output power/W
图2-7微波辐射功率对提取率的影响
Fig.2-7 The effect of microwave output power on extracting ratio
由图2-7可以看出，微波功率在180W~540W范围内迷迭香酸的提取率随微波功率反而略有降低。这可能是由于微波辐射功率过高，使迷迭香酸分子破坏所致。因此，微波功率以540W为宜。
(2)微波辐射时间的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香干叶，加入15%的乙醇，料液比为1：5，控制微波输出功率分别为540W， 每次连续辐射时间分别为3min、6min、9min、12min， 共辐射6次，由2.4.5计算提取率，微波辐射功率对提取率的影响如图2-8所示。
93.5
x
93
92.5
92
91.5
91
3
6
9
12
15
Microwave extracting time/min
图2-8徽波辐射时间对提取率的影响
Fig.2-8 The effect of microwave extracting time o next racing ratio
由图2-8所示，随着微波辐射时间的增长，产品的提取率相应增加。但连续辐射超过6分钟提取液产生剧烈沸腾，且提取率增加比较缓慢。所以每次连续辐射时间以6分钟为最佳。
(3)微波辐射次数的选择
称取50g粉碎度为20目的迷迭香千叶，加入15%的乙醇，料液比为1：5，微波输出功率为540W， 每次连续辐射时间为6min， 辐射次数分别为1、2、3、4、5、6次，由2.4.5计算提取率，辐射次数对提取率的影响如图2-9所示。
100
80
ox
60
40
20
0
0
2
3
4
5
6
7
Microwave extracting times
图2-9微波辐射次数对提取率的影响
Fig.2-9 The effect of microwave extracting times on extracting ratio
从以上实验数据看出，随着微波提取次数增多，迷迭香酸的提取率逐渐增长，但辐迷迭香中迷这香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究射次数超过4次以后趋于缓慢，辐射4次时其迷迭香酸的提取率已达92.56%。从节能、生产成本等方面综合考虑，故实验选取辐射次数以4次为宜。

由以上实验可得微波法提取迷迭香酸的最佳工艺条件为：==物料破碎至20目、以15%的乙醇为提取剂、料液比为1：5(w/v)进行微波法提取，微波功率为540W、辐射时间为6min、共辐射4次。迷迭香酸的提取率可达到92.59%==，
## 2.5.3超声波辅助微波法提取迷迭香酸
由于超声波的特殊作用，在微波法提取迷迭香酸的最优条件下，先以超声波辅助破壁，然后以微波法提取，考察了超声时间对迷迭香酸得率的影响，实验结果如图2-10
所示。
95
94.5
o
94
93.5
93
92.5
5
10
Ultrasonic-assisted extracting time/min
15
20
25
30
35
0
图2-10超声波辅助提取时间对提取率的影响
Fig.2-10 The effect of ultrasonic-assisted extracting time on extracting ratio
由图2-10可知在微波法提取迷迭香酸的最优提取工艺条件下，加以超声波辅助破壁， 可以有效地提高提取的效率。但用超声波处理的时间大于10min后迷迭香酸的提取率反而有所下降，可能是用超声波处理时间过长，会使迷迭香酸分子受到破坏，从而影响了提取率， 所以选择超声波预处理的时间为10min， 迷迭香酸的提取率可达到94.54%。
2.5.4三种提取工艺最佳条件的比较

比较三种工艺最佳条件下提取迷迭香酸的效果，结果如表2-1。
18
迷香中迷逸香酸的提取纯化及提取物活性测定的研究
表2-1不同提取方法的比较
Tab.2-1 The comparison between different extracting method
K露波辅助
超声波辅助
提取方法
常规法提取
微波提取
微波提取
提取时间
料液比
4h
1：7
24min
1：5
34min
1：5
提取率
94.07%
92.59%
94.54%
由表2-1可以看出常规法提取迷迭香酸提取效率高，可达到94.07%，但提取时间比较长，且溶剂消耗比较大，对下一步的浓缩也带来困难；微波法提取迷迭香酸相对常规提取来说，提取时间缩短了很多，节约了溶剂，提取率可达到92.59%；

在微波最优工艺的基础上==采用超声波辅助微波提取，则在总体上保持了微波法提取时间短，溶剂消耗量少的优点，使提取更加充分，把提取率提高到了94.54%。==

# 2.6小结
通过对迷迭香中迷迭香酸三种提取工艺的研究得到以下结论：

(1)常规热回流提取法最佳的提取条件为：

物料破碎至20目，
	用15%乙醇溶液，在料液比为1：7(w/v)，提取温度为85℃的条件下，提取4次，每次为1h，
	得到迷迭香酸的提取率为94.37%。
(2)微波法提取迷迭香酸的最佳工艺条件为：

物料破碎至20目、
	以15%的乙醇为提取剂、料液比为1：5(w/v) 进行微波法提取， 微波功率为540W、辐射时间为6min、共辐射4次。
	迷迭香酸的提取率可达到92.59%，
(3)迷迭香中迷迭香酸的最佳提取工艺条件为：

物料破碎至20目、以15%的乙醇为提取剂、料液比为1：5(w/v) 、超声时间为10min，
	然后进行微波法提取， 微波功率为540W、辐射时间为6min、共辐射4次，
	迷迭香酸的提取率可达到94.54%。
此迷迭香酸提取工艺设备简单可行，提取工艺很大程度地==缩短了提取时间、减少了溶剂用量、降低了能耗==，并且迷迭香酸提取率比常规法的提取率都要高，表现出明显的优势，为迷迭香酸的工业化提取提供了理论依据。