ATP活体生物检测

腺嘌呤核苷三磷酸（简称三磷酸腺苷， adenosine triphosphate，ATP ）是一种不稳定的高能化合物，由1分子腺嘌呤，1分子核糖和3分子磷酸基团组成。又称腺苷三磷酸，简称ATP。腺苷三磷酸（ATP ）是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。
ATP是一种不稳定的高能磷酸化合物，在细胞中，它能与ADP的相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。生成ATP的途径主要有两条：一条是植物体内含有叶绿体的细胞，在光合作用的光反应阶段生成ATP；另一条是所有活细胞都能通过细胞呼吸生成ATP。
HPLC法是测定ATP含量的一种常用方法，它能够快速、准确地分析细胞中的ATP含量。
该方法基于ATP分子中含有三个磷酸基团，这些磷酸基团可以被酶水解成无色的无机磷酸盐。通过测定ATP水解产生的无机磷酸盐的浓度，可以间接地推断出样品中ATP的含量。HPLC法具有重现性好、灵敏度高、测定时间短的优点，但需要专门的仪器设备和专业的技术人员。

背景技术：
三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）存在于从微生物到高等动植物所有的生物体中，是各种生命活动能量的直接来源，但本身在体内含量并不高，在细胞中ATP的摩尔浓度通常是1-10 mM。
ATP在细胞内主要作用是提供能量，参与脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，在维持生物体的正常机能上有无可替代的作用。
==ATP是活细胞的重要能量组分，死亡的细胞将不能测到ATP==，癌细胞的ATP代谢特别活跃。
通过测定细胞内ATP的含量不仅可以观察细胞的状态，还可以观察不同外界因素对细胞的效应。
迅速而准确地测定ATP，对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程、进行药物敏感实验以及食品卫生监控都有非常重要的意义。
ATP的检测被广泛应用于包括肿瘤药物敏感性筛选、细胞凋亡检测、多种重要细胞活性及微生物含量分析等方面。发展ATP的新型检测方法对于医学临床诊断及机体代谢水平具有重要意义。
建立简单、快速、灵敏和准确的ATP分析方法不仅有助于推动生命过程的研究，而且对于临床诊断、药物分析、药物开发等领域也有着重要的实际意义。
传统的ATP检测方法有电泳法、高效液相色谱法、同位素示踪法、生物发光法和化学发光法。
在电泳法测定ATP中，样品需经电泳分离，再利用紫外分光光度计进行比色，操作比较复杂；采用高效液相色谱法需要繁琐的分离过程，仪器与试剂昂贵，检测时间长，检测器多为紫外检测，灵敏度有限，微量的ATP很难准确检测。
同位素示踪法具有简单、灵敏的优点，但放射性同位素影响实验操作者的健康，应用难度大。
化学发光法和生物发光法虽然具有很高的测量精度，能够满足不同范围的检测要求，但是其稳定性和特异性是一直存在的问题。
因此，急需建立价格低廉、灵敏度高、特异性好的ATP检测方法。
技术实现要素：
为了解决以上现有技术中检测ATP的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于核酸外切酶III协助的双放大荧光法检测ATP的生物传感器。
本发明还提供了上述生物传感器荧光检测ATP方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测三磷酸腺苷（ATP）的生物传感器，包括核酸外切酶III（ExoIII）引发链（Trigger），ATP适配体（Aptamer），发卡探针（HAP）和分子信标（MB）；
所述引发链的序列如SEQ No. 1所示；
所述ATP适配体的序列如SEQ No. 2所示；
所述发卡探针的序列如SEQ No. 3所示；
所述分子信标的序列如SEQ No. 4所示，其中5’端修饰荧光基团，3’端第四位碱基上修饰荧光猝灭基团。
作为优选，所述荧光基团为6-羧基荧光素（FAM），荧光猝灭基团为4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（Dabcyl）。
一种采用上述生物传感器检测ATP的方法，包括以下步骤：
（1）将引发链和ATP适配体杂交为探针；
（2）将ATP标准溶液与待测液分别与探针混合，同时加入发卡探针、分子信标、核酸外切酶III和反应缓冲液，37℃恒温孵育；
（3）将步骤（2）所得的溶液检测荧光，根据ATP标准溶液的荧光强度作标准曲线，计算回归方程，由待测液的荧光强度计算其中ATP的浓度。
所述步骤（1）中杂交步骤为95℃下变性，然后缓慢冷却至室温。
Exo III酶浓度为10-150U/mL；优选为10-100U/mL。
HAP浓度为1-6μM；优选为1-5μM。
MB浓度为2-12μM；优选为2-10μM。
孵育时间为60-150min；优选为60-120min。
所述荧光检测的激发波长为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm。
本生物传感器的工作原理如下：
Trigger与Aptamer进行碱基互补配对形成弓型结构。当有ATP存在时，Aptamer与ATP进行结合，这可以将弓型结构打开，同时使得Trigger释放。释放出的Trigger可以与HAP的3’端进行碱基互补配对，使得HAP的3’形成平末端，在核酸外切酶III的作用下产生R序列，同时Trigger链进行循环利用，实现外切酶III的第一次循环放大。随后，R与MB杂交，将MB的发夹结构打开形成双链结构，外切酶III作用于MB使得R进行循环利用，实现外切酶III协助的第二次循环，同时MB上的荧光基团与猝灭基团分离，产生荧光信号，通过测量荧光强度来定量检测ATP。
本发明具有以下优点：
本发明的生物传感器的特异性好、灵敏度高，反应条件温和、重复性好；检测方法操作简便、检测周期短；检测的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本生物传感器的工作原理示意图；
图2为Exo III对检测ATP荧光强度的影响；
图3为不同浓度HAP对检测ATP荧光强度的影响；
图4为不同浓度MB对检测ATP荧光强度的影响；
图5为不同反应时间对检测ATP荧光强度的影响；
图6为系列浓度ATP的荧光强度；
图7为检测ATP的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 不同浓度Exo III对检测ATP荧光强度的影响。
（1）将14 μL 灭菌水，2 μL Exo III酶缓冲液，2 μL 100 μM Aptamer链和2 μL 100 μM Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中；震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用。
（2）取6μL步骤（1）中的溶液加入EP管中，紧接着加入ATP（5 μL，102 nM）、HAP（3 μL，5μM）、MB（6 μL，10μM）、3 μL Exo III（浓度分别为10 U/mL，25 U/mL，50 U/mL，75 U/mL，100 U/mL，125 U/mL，150 U/mL），6 μL ExoIII酶缓冲液和31 μL灭菌水。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h。
（3）将60 μL上步反应后的溶液稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm，读取荧光信号变化。
结果见图2，从图中可以看出，随着核酸外切酶III量的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在酶量达到100 U/mL之后，荧光强度基本不变。
实施例2 不同浓度HAP对检测ATP荧光强度的影响。
（1）将14 μL 灭菌水，2 μL Exo III酶缓冲液，2 μL 100 μM Aptamer链和2 μL 100 μM Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中；震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用；
（2）取6 μL步骤（1）中的溶液加入EP管中，紧接着加入3 μL HAP（终浓度分别为1 μM，2 μM，3 μM，4 μM，5 μM，6 μM）、ATP（5 μL102 nM）、MB（6 μL，5μM）、核酸外切酶III（3 μL，100U/mL），6 μL ExoIII酶缓冲液和31 μL灭菌水。震荡30 s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
（3）将60 μL 上步反应后的溶液稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围500 nm-650 nm，读取荧光信号变化。
结果见图3，从图中可以看出，随着发夹HAP的浓度增加，实验得到的荧光强度不断增强，在发夹HAP浓度达到5 μM之后，荧光强度基本不变。
实施例3 不同浓度MB对检测ATP荧光强度的影响。
（1）将14 μL 灭菌水，2 μL Exo III酶缓冲液，2 μL 100 μM Aptamer链和2 μL 100 μM Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中；震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用；
（2）取6μL步骤（1）中的溶液加入EP管中，紧接着加入6 μL MB（终浓度分别为2 μM，4 μM，6 μM，8 μM，10 μM，12 μM）、ATP（5 μL102 nM）、HAP（3 μL，5μM）、Exo III酶（3 μL，100U/mL），6 μL ExoIII酶缓冲液和31 μL灭菌水。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
（3）将60 μL上步反应后的溶液稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm，读取荧光信号变化。
结果见图4，从图中可以看出，随着MB浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在MB浓度达到10 μM之后，荧光强度基本不变。
实施例4 不同反应时间对检测ATP荧光强度的影响。
（1）将14 μL 灭菌水，2 μL外切酶缓冲液，2 μL 100 μM Aptamer链和2 μL 100 μM Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中；震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用；
（2）取6μL步骤（2）中的溶液加入EP管中，紧接着加入HAP（3 μL，5μM）、ATP（5 μL，102nM）、MB（6 μL，10μM）、核酸外切酶III（3 μL，100U/mL），6 μL ExoIII酶缓冲液和31 μL灭菌水。震荡30 s，放入37℃的恒温箱中分别孵育60 min，75 min，90 min，105 min，120 min，135 min，150 min。
（3）将60 μL上步反应后的溶液稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm，读取荧光信号变化。
结果见图5，从图中可以看出，随着反应时间的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在反应时间达到120 min之后，荧光强度基本不变。说明核酸外切酶III协助的双循环放大检测ATP的最佳检测时间为120 min
实施例5 对ATP的荧光检测。
（1）将14 μL 灭菌水，2 μL ExoIII缓冲液，2 μL 100 μM Aptamer链和2 μL 100 μM Trigger链加入到预先准备好的灭菌的EP管中。震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用；
（2）取6μL步骤（1）中的溶液加入EP管中，紧接着加入5 μL ATP（终浓度为0，1×10-3，1×10-2，1×10-1，1，1×101，1×102 nM）或待测液、HAP（3 μL，5μM）、MB（6 μL，10μM）、ExoIII酶（3 μL，100U/mL），6 μL ExoIII酶缓冲液和31 μL灭菌水。震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2 h；
（3）将60 μL上步反应后的溶液稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围500nm-650nm，读取荧光信号变化。
检测结果如图6所示，图中可知，当ATP浓度在1 pM到1×105 pM时吸光值不断减小，反应稳定进行。在ATP的浓度在1 pM到1×105 pM时，ATP浓度的对数与荧光峰值的大小成正比关系，拟合曲线：F = 15.8 + 145.9×log (CATP / pM)，其中，Y是荧光强度峰值，C是ATP的浓度。R为0.985。经计算得到该方法的检测下限为0.8 pM。经测定，待测液的荧光强度是201，ATP的浓度为18.3 pM。计算得到该方法的检测下限为0.8 pM。