菌落总数检测的注意事项与快速检测技术

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RLU
爱德克斯 
云唐
优云普
霍尔德

一、 传统检测方法
1.传统检测方法的流程图[2]
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2.注意事项
国标法测菌群总数是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或mL检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。国标法检测应注意以下问题：
2.1 所用器皿及稀释液
2.1.1 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。
2.1.2 用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。
2.1.3 检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则需采用蒸馏水。
2.2 样品稀释
2.2.1 检样稀释时,无菌称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成1:10的稀释液。制备10倍系列稀释的样品匀液时，每一步都应该摇匀试管或反复吹吸，使菌体能够尽量分散均匀。如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000-10000rpm速度搅拌1分钟，使做成均匀的1：10稀释液。对于像食醋或酸性饮料等酸度较高的样品，如果直接用原样液来检测菌落总数，结果会偏低甚至为0 ，只有严格按标准要求先用灭菌的20-30%碳酸钠溶液将其PH值调至中性后方可准确检测出菌落总数。
2.2.2 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1:10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成1:100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1:1 000、1:10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。
2.2.3 从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
2.2.4 在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。   
2.2.5 当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
2.3 平板接种与培养
2.3.1 将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作1O倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。
2.3.2 培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2h。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点．果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±2h培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。
2.4 菌落计数
2.4.1 在进行菌落计数时，有一些样品的残渣会在视觉上与菌落混淆，因此，在进行计数时应该仔细分辨。菌落的形状相对规则，比较有光泽度，更饱满，而样品的残渣比较不规则，没有菌落的饱满度和光泽度。另外，还可向培养基中添加一定浓度的TTC，可以使菌落成红色，便于观测和计数，但TTC的浓度不宜过高，否则会抑制菌落的生长。
2.4.2 从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。
2.4.3 菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。
2.4.3.1 若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之。
2.4.3.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数。
2.4.3.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
2.4.3.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
二、快速检测新技术
1.3M测试片快速分析技术
1.1 3M测试片快速分析技术概念
3M测试片法是一种便捷可再生水化干膜，适用于细菌和真菌的计数。
https://wenku.baidu.com/view/abaa0ec0a2c7aa00b52acfc789eb172ded6399b4
![](/media/202405/2024-05-19_192643_546321.png)
1.2 检测步骤
只需三步就可实现快速准确的测定。(以大肠杆菌的为例)
![](/media/202405/2024-05-19_192728_645025.png)
1.3 结果判读
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①测试片中含有一种红色指示染剂可使菌落着色，计算所有红色菌落(不论其大小和颜色深浅均计算之)。
②测试片上没有任何菌落生长。
③有不多的菌落。
④测试片菌落数适宜计数范围是25-250。
⑤测试片面积约为20平方厘米，当菌落数超过250个，如5所示，为了估计菌落数，可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格(1cm2)，计算平均菌落数，再乘以20可得到整个测试片上的菌落数。
⑥ 测试片上菌落太多而无法计数。
⑦有很多高数量菌落，使整个生长区变粉色，应计录为菌落太多无法计数。
⑧有时菌落分布出现不均衡，如8所示,这也记录为菌落太多无法计数。
⑨测试片上的菌落,最先粗略一看是可计数的，然而，你密切注意到生长区边缘，能看到高密度的菌落，应记录为菌落太多无法计数。
1.4 测试片法特点
1.4.1 工作效率的极大提高
根据大量数据统计，使用 3M测试片技术， 可以提高实验室工作效率 118% 以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最终的效果就是效益的增加。
1.4.2 标准化的检测方法
品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。
1.4.3 国际化的认证方法
3M快速测试的方法得到包括 AOAC，AFNOR 在内的国际权威机构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。
1.4.4 快速得到检测结果
对比传统的测试方法， 3M快速测试片缩短检测时间，使您在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题。
1.4.5 方便进行HACCP 认证
由于检测速度快，检测项目全，准确性高。
3M为食品生产工艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，可以对包括生产线，生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测试。

2.ATP法
2.1 ATP荧光法检测总菌落数原理
萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂—荧光素酶、虫荧光素(D-luciferin)以及所有细胞生物都产生的生物能量物质—三磷酸腺苷（ATP）。
在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：
https://www.huoerd.com/atpygjcy/677.html
https://www.atpyq.com/zsnews/41.html
https://www.sohu.com/a/405661616_120229188
TS3细菌总数检测仪‘
http://www.foodmate.net/yiqi/1785/show_164221.html
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2.2 ATP法特点：
2.2.1 具有成本低，操作简单，响应速度快等特点，
2.2.2 微生物 ＡＴＰ 生物发光法在国外已被广泛地运用于食品中菌落总数的测定。
3.MTT法
3.1 MTT法检测原理
检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
Formazan结晶形成的量与活菌数成正比。
用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活菌细胞数量。
## 3.2 应用实例：巴氏消毒奶中活菌素快速检测
取巴斯消毒奶10mL ，至于无菌离心管中3000rpm离心5分钟，弃去上清。
加入10mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次3000rpm离心5分钟，弃去上清取出奶液基质。
加入1mL生理盐水重悬底部的微生物，取0.2mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌液做标准曲线，统一加入底物反应30分钟，读数。
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3.3 该方法的特点：检测快速，灵敏度高。
# 4.流式细胞术
4.1 流式细胞术检测原理
检测原理：细胞经特异荧光素标记后，通过激光照射，产生特异荧光信号，通过对这些荧光信号的检测和定量计算出菌群总数。

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4.2 特点：快速、便捷结果可靠、便于操作。

结语：
菌落总数是微生物检测中最常见的项目，在检验的每一个环节都应该小心谨慎，精准操作，确保检测结果的准确度。国标法采用的平板计数法是我们最常用的检测方法，但是操作过程较为复杂，时间较长；而其他方法操作简便，省时，但是有的成本相对较高，并且有的只针对特定的食品种类。我们应该积极关注新的科学技术在检测方法中的应用，让检测更加精确、经济、便捷和可靠。