动物源胶原蛋白提取技术

动物源胶原蛋白提取技术
动物源胶原蛋白通常是从陆生哺乳动物中提取，猪和牛的皮、骨头是胶原蛋白的主要来源，考虑到哺乳动物有口蹄疫、疯牛病的风险，人们开始采用鱼鳞、鱼骨、鱼皮作为制备胶原蛋白的原料。水产品加工副产物约 30%为鱼皮和鱼骨，其具有高胶原蛋白且更安全的特性，另外，产业开始研究从鸡蛋膜、鸡皮、牛蛙皮及兔肉等加工副产物中提取胶原蛋白。
动物源胶原蛋白提取从陆生哺乳动物→水产品→农产品。
## -ONE-来源与生产工艺
动物胶原来源：牛和猪已形成产业化运用。从不同原料来源的胶原蛋白肽中含有的特征性氨基酸羟脯氨酸含量来看品质，畜禽皮＞淡水鱼皮鱼鳞＞深海鱼皮，实际生产过程中，畜禽皮骨及淡水鱼鱼皮鱼鳞的原料来源得以充足保证，并且其胶原含量达 20%-30%，含量高于牛和猪的 10%-20%，但应用范围以食品为主，较少应用于医疗及化妆品领域。牛胶原及猪胶原的提取率较高，可用于食品、化妆品、医疗器械等领域，产业化应用广泛。
表 1 四类动物源提取胶原效率、优缺点及适用情况 
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动物源提取方式多样，酸法及酶法已形成产业化运用。动物源胶原蛋白可通过酸法提取、碱法提取、酶解法提取、中性盐法提取及热水法提取，同时也可通过复合法进行提取，例如酸酶复合法、酸与热水复合法等，复合使用起到改良提取效果的目的。酸法及酶法已经形成了产业化的运用，酸法提取即将胶原蛋白置于酸性介质中以溶解胶原蛋白，通过盐析、透析等步骤得到酸溶性胶原蛋白，可以得到完整的三螺旋结构并保持胶原蛋白的生物学特性，成本低、经济价值高，但酸法提取的效率较低，且保留胶原的端肽，存在高免疫原风险。酶法提取则用蛋白酶切除胶原蛋白的非螺旋端肽，可使用的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等，保持完整的三螺旋结构，酶法提取具有安全性高、纯度高、理化性质稳定等优势，提取广泛用于生物学材料。酶具有专属性，胶原对胶原酶以外的蛋白酶有抵抗作用，酶法提取可得到专属的胶原蛋白，实验的提取率可达97.7%，通过多种酶混合提取可得到多重功能的胶原蛋白，通过蛋白酶可切除、消化胶原的端肽，降低免疫原性，但各种酶解条件的控制，极大的影响所制备胶原的结构完整性、稳定性、提取的得率等方面。
表 2 动物源提取胶原蛋白的主要方式
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## -TWO-溯源与免疫原性清除
原材料溯源，严格控制防止病毒性问题。动物源提取胶原蛋白面临免疫性和病毒性两大问题，成为动物提取的难点。目前工艺技术已经逐渐克服这两大困扰，原料按照药品规则进行管理规范，生产过程中要求用于药品的原材料能够溯源，牛或者猪出生至屠宰期间需要有全部的饲养记录和用药记录。原材料端严格控制，可有效避免疯牛病、口蹄疫等人畜共患疾病的发生。
免疫原性的来源：通过动物源提取的胶原蛋白免疫原性受到纯度、结构、供体/受体种属特征、提取方式、植入部位、交联方法等六大因素影响。动物源免疫原性的不确定性是胶原蛋白临床应用的最主要风险，也是药监局监管重点。材料的危害主要涉及：细菌、霉菌或酵母菌污染，病毒污染，传播性海绵状脑病（TSE）因子污染，寄生虫或其他未分类的病原体污染等；由杂质及未清除的细胞抗原，如常见的α-Gal抗原引起的免疫学反应和热原反应。
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图 1动物提取胶原蛋白免疫性的六大影响因素
免疫原性清除有多重方法，包括脱细胞和细胞抗原；去除杂质，如变性的杂蛋白或非目标蛋白；交联处理以对材料的抗原表位进行封闭；脱脂及去除外源微生物、低温冷冻处理、脂多糖的清除等，并且不同组织来源材料的清除方法有所不同。以端肽去除免疫性进行举例，以I型胶原蛋白为例，I型胶原蛋白的Gly-X-Y重复序列两侧，存在由C端、N端的2个前肽形成的非螺旋结构，也即免疫原主要分布区域，在胶原提取过程中通过水解或是在蛋白酶的作用下，可将端肽剪切去除使其失活，制备去端肽Ⅰ型胶原蛋白，降低其免疫原性。实验通过酶切、盐析、透析工艺制备的去端肽Ⅰ型胶原蛋白，纯度较高，胶原中一些潜在的免疫原性物质，如核酸、蛋白、多糖、脂质、α-Gal抗原和其他小分子物质等，仍然可能引起免疫应答但影响有限，通过端肽去除可基本规避天然胶原蛋白的免疫原性根源，有效控制风险。
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图2 免疫原性有多种清除方法，端肽去式举例
## -THREE-分离纯化
分离提纯步骤：经过蛋白酶酶解过后，会得到多肽、多种氨基酸、小分子蛋白等复杂的混合物，需要通过分离纯化技术得到高纯度或高活性的抗氧化多肽制品。在分离纯化之前，首先需要了解分离纯化的目的，产品纯度和总回收率两者难以兼顾，科研工作中优先前者而生产中注重高回收率。另外，还需要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质，提取过程中需要保证蛋白质组成成分、结构性质和生物活性不发生改变。胶原的纯度影响下游端的应用及安全性，成为衡量胶原蛋白制备工艺中的核心指标之一。
分离提纯方法：根据蛋白质特征进行差异化提纯。根据蛋白质分子大小不同、溶解度不同（pH值、离子强度、介电常数和温度等）、酸碱性质不同和亲和力不同，对提纯方法进行划分，可分为透析、超滤、离心和凝胶过滤、等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法、电泳和离子交换层析等方法。
图3根据蛋白质特征不同带来的分离提纯方式差异 
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分离纯化过程中的技术参数影响产业化运用及生产成本。透析的孔径、温度、酶的比例等各类技术参数和反应条件影响了动物源胶原蛋白的规模化生产，技术参数的改变可影响提取工艺的回收率，前文所说提纯过程讲究纯度及回收率的平衡，二者难以兼得，纯度影响了胶原蛋白的应用及安全性，而回收率则决定了工业生产的成本。目前动物源生产过程中，行业内多采用半自动化工艺，而从基因工程制备的过程中，同样面临分离纯化成本高昂的桎梏，成为规模化生产的限制因素，预计随着行业进步带动半自动化生产向全自动化的发展，成本有边际下降空间。